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离线孙凯宾

实习生

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只看楼主倒序阅读楼主发表于: 2008-07-02

显微摄影是一项重要的显微技术，同再现显微镜中物体影象的各种方法比较，显微摄影是最好的方法。它对以显微镜作为研究工具的研究人员是必备的手段，尤其在研究染色体及其分子特征时，就更加显得必要了。现在数码相机的问世，又使显微摄影变得更为简便，且效果好。在有关学术研究和理论探讨时，一帧好的显微照片，可以省去许多的文字描述，并且使人心悦诚服。何况在生物学领域中，确有不少问题的研究，必须借助显微摄影。

下面，仅以植物染色体作为拍摄材料，概述显微摄影的基本方法，数码显微摄影的操作流程和传统的显微摄影基本一样，只是省去了底片和暗房技术，由计算机完成。

一、显微摄影对制片标本的要求

染色体只见于有丝分裂和减数分裂的细胞核中，根尖、茎端、幼嫩花药和胚珠是镜检染色体的材料，尤以根尖和花药更为常用。观察染色体的形态、结构和数量，常用酶解或压片法制片。此法能保持染色体的完整，并能接近于活体状态。一张好的显微照片，来源于完好的染色体制片标本。适于拍照的制片标本，应具下列条件：

1、选用标准的载玻片和盖玻片光源入射光束，经载玻片透射标本，再经盖玻片进入物镜，处于光路之中的玻璃，应是表面无伤，内无气泡；外无霉斑。这样可以杜绝光线乱反射，防止阻光、降低亮度以及有损清晰度。载玻片厚度不宜超出聚光镜的焦距，一般在2毫米以内，可将光源的光束集中于载玻片的标本上。盖玻片的标准厚度为0.17毫米，若使用厚度大于工作距离的盖玻片，物镜前透镜会触及盖玻片，同时不能准焦；盖片厚，球差就大，会降低影象质量。有效盖片厚度，包括封固剂的厚度，即树胶或尤派胶用量，因此，封固剂要调稀，少许滴加一薄层。

2、染色体处于相宜的时期，平展逸散，完整无损染色体的计数和组型分析，以有丝分裂的中期(或晚前期)，减数分裂的终变期和粗线期为宜。这时染色体收缩变短，呈典型状态，易识别。通过前处理的精细加工，染色体相互逸散，互不接触，并尽可能使之平展于同一水平面上，又不失细胞的完整轮廊(图3-1)。

3、染色鲜明适度染色体过染，染料堆积，使染色体模糊成一块，难以辨别细节，缺乏质感；染色体着色过浅，使影象不鲜明，辨认不清，反差不大。染色体染色以蓝紫为佳，色彩鲜明，胶片易感受，拍摄效果好。一般多用铁矾苏木精染色制片。当然，醋酸洋红和孚尔根反应也可以。细胞质染色应浅淡，以辨清细胞质的完整轮廓为准。常用铁矾苏木精过染，再用45％醋酸软化和分色，结果染色体着色蓝黑而鲜明，细胞质浅淡而不明显，增大了色彩的对比，扩大了影象的明暗反差。

4、清洁无尘，消除气泡制片中的灰尘异物和气泡，有损影象的质量，防碍观察。气泡为临时制片的常见弊病，小的气泡有碍观瞻；大的气泡连片，推挤染色体，堆积集中，损坏了好的影象。要随时滴加所用的临时封固液，消除气泡。

二、选用优质物镜和接目镜

显微摄影是以接物镜和接目镜作为摄影镜头，其中接物镜尤为重要，物镜的分辨率就是显微镜的分辨率。目镜与显微镜的分辨率无关，它只有把物镜已放大的影象进一步放大，既使是最好的目镜，也无法观察到未被物镜分辨的细节。所以摄影时，物镜要严格选择，不可任意滥用。

1、物镜接物镜种类繁多，光学性能相差悬殊。摄影时必须选用得当，绝非任一物镜皆可产生最佳影象。

物镜由透镜组成。单片透镜具有多种象差，一个完善的物镜，是由一组复杂的透镜组成。按象差矫正程度，物镜可分消色差物镜，复消色差物镜，萤石物镜和平象物镜等类别。

消色差物镜，因制造容易，是最常见的物镜。金属外壳上不刻代表(图3-4左)。该物镜将光谱中红光和蓝光聚焦于一点，黄绿光则聚焦于另一点。其最佳清晰范围是在510μm(毫微米)绿光区至630μm橙光区间(图3-2Ach红)。消色差物镜性能较差，不适于显微摄影。因未经矫正的蓝光对感光胶片的乳剂膜非常敏感，全色胶片对未经矫正的红光也能感应。如果必须使用时，加用黄绿色滤色片，也可获得清晰的影象。

复消色差物镜的性能很高，能将可见光谱中的红、蓝和黄光聚焦于一点，改正了红、蓝色光的球差和其他象差。最佳清晰范围从波长400nm至720nm(图3-2Apo线)，容纳了全部可见光谱。适于任何色光下或加用各色滤色镜摄影，更适于彩色摄影。但是，复消色差物镜残留有象场弯曲，使平面物体形成类似球形弯曲的影象。结果使视野中心和边缘的影象不能同时准焦，给摄影带来不便。拍出的底片中心清晰边缘模糊或相反。象场弯曲可以通过选用特殊的目镜加以克服矫正。复消色差物镜的金属外壳，刻有“Apo”字样，供作识别(图3－3)。

萤石物镜，色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间，故又可称半复消色差物镜。最佳清晰范围在波长430nm至680nm(图3-2 l线)，包括了绝大部分可见光谱。适于黑白和彩色摄影，可加用各色滤色镜，物镜外壳刻有“F1”字样(图3-4右)。

鉴于倍数愈高物镜的象场弯曲愈显著，歪曲影象，降低摄影质量，难以获得完美的底片。现今，已研制出清除象场弯曲的一系列平象物镜。平象物镜，校正了象正场弯曲，不存在视野中心与边缘不同时准焦的现象。由于将影象展平，在同样倍数下，有效影象要比一般物镜的影象稍大。为当今理想的摄影物镜，应积极选用。平象物镜有多种类别，外壳上刻有不同的字样，以资识别。如“Plan”(平象)，“Pl”(广视野平象)、“NPl”(正常视野平象)，“Planachromate”(平象消色差)、“Pl Apo”(平象昨消色差)等(图3－5)。

物镜在使用时，按其前透镜与标本间介质的不同，分为干燥系和浸没系物镜。浸没系物镜外壳前端，常刻一黑环，以便识别。油浸物镜外壳刻有“Oel”、“Oil”、“Hl”字样；水浸系物镜刻有“W”、“Water”；甘油浸没系物镜刻有“Glyc”、“Glyz”，通常油浸物镜只有90×和100×(图3－6)高倍物镜。个别显微镜配有63×或40×的中倍油浸物镜，其中尤以63×的油浸物镜，质量最佳，非常适于显微摄影。在焦距和数值孔径相同时，浸没物镜的象差校正比干燥物镜完善，成象质量好。由于浸没液折射率大于空气的折射率，从而提高了物镜的分辨率。同时，这层介质可使入射物镜的光线提高，提高视野亮度。采用浸没物镜，可消除物镜前端透镜表面的杂乱反射光，减少有害的反射光量，使物体影象反差增加。

2、目镜目镜亦参与造象，把物镜映来的影象进一步扩大，并校正物镜余下的象差和色差。目镜作为投影器，把放大的影象投射在暗箱的焦平面上。目镜种类多，光学性能差异较大，一定类型的物镜必须选用一定类型的目镜相互组合。绝非只要有好的物镜，随便一种目镜都可用来摄影。

附有摄影装置的显微镜，备有摄影目镜，专用摄影，不宜作为观察用。这种目镜能较好的校正象场弯曲，提高成象质量。摄影目镜上刻有“Photo”、“FK”等字样。
平象目镜也是一种适于摄影的目镜。有专用摄影目镜，选用平象目镜配合平象物镜一起使用，可以获得很好的摄影效果。目镜刻有“Plan”、“Periplan”、“GF”、“GW”和“Kpl”等字样。

3、物镜与目镜组合为提高影象质量，消除象差和色差，在选配物镜和目镜组合时，从类别上进行选择，如用平象复消色差物镜和摄影目镜或平象目镜组合使用。此外，物镜的数值孔径和放大倍数，以及目镜的放大倍数，更要考虑这涉及有效放大率、分辨率、焦点深度和视野宽度等几个与摄影质量相关的问题。所以，选用物镜和目镜时，要考虑下述几个问题：

（1）有效放大率：显微镜辨别微小物体和细节的能力，取决于分辨率，不在于放大倍数。分辨率决定于物镜，而与目镜无关。显微镜的有效放大率，为所用物镜数值孔径的500－1,000倍。数值孔径常简写为N.A.，其数值刻在物镜上。例如，使用数值孔径为0.65的40×物镜，其有效的放大倍数为325－650倍。为达此倍数，要选用8-16倍的目镜。高于16×目镜所得放大倍数叫做“空的放大”，对影象细节的分辨，没有丝毫提高。目镜倍数太低，总放大倍数太小，物镜分辨率不能充分发挥，本来可以辨认的细节，由于总倍数太小，挤在一起难以分辨。

（2）分辨率：显微镜的分辨力决定于物镜数值孔径，孔径愈大，分辨率愈高。数值孔径与物镜倍数有关，请看下列数字：
物镜倍数 4× 10×   20× 40× 100×
数值孔径 0.1 0.25 0.40 0.65    1.25
上列数字表明，随着放大倍数的加大，数值孔径相应提高，分辨力随之增大，欲提高对物象细节的分辨能力和清晰度，必须使用高数值孔径的物镜。例如，拍摄染色体减数分裂前期Ⅰ的几个影象，非用高分辨率的油镜不可，摄影目镜应视物象的大小和视野宽度，选用低倍的目镜为宜。在这里要考虑物镜的数值孔径，不是总放大率，单纯考虑放大倍数，不顾及分辨率，就会出现摄影质量相差悬殊的结果。例如，用100/1.25物镜与4×目镜组合，总放大倍数为400倍，分辨距离为0.27微米；使用40/0.65的物镜与10×目镜组合，总放大倍数也是400倍，分辨距离下降到0.5微米。尽管总放大倍数相同，物象微细结构的分辨力几乎相差一倍。
（3）焦点深度和视野宽度：焦点深度是指物象的某一点被准焦时，其清晰部分的上下距离(厚度)。焦深大，清晰的深度大，焦深小，清晰的深度小。染色体数目较多的植物，例如八倍体小黑麦2n＝56，制片时难以把所有染色体平展一薄层，56条染色体纵横交错，散在不同的水平层次上。因此，若缺少足够的焦点深度，难把众多的染色体清晰地反映在同一张底片上。焦点深度与物镜的数值孔径和总放大倍数成反比。数值孔径小，放大倍数低的物镜和目镜，焦深长，只有选用数值孔径小和放大倍数低的物镜和目镜，加长焦点深度，才能把处于不同水平层次的染色体，清晰地摄入同一张底片内。
视野宽度与显微镜的总放大率成反比，使用高倍物镜和目镜，视野缩小，难在同一视野内容纳一个细胞的全部染色体。改用低倍的物镜或目镜，降低总放大率，放大视野，以至能包括一个细胞的所有染色体止。
综上所述，物镜数值孔径大，分辨率高，物象清晰，焦点深度和视野宽度降低，选用物镜和目镜主要着眼于提高物体影象的分辨率和清晰度，即选高数值孔径的平象复消色差中、高倍油浸物镜，兼顾焦点深度和视野宽度，并选用相宜的低倍摄影目镜或平象目镜。焦深和视野不足时，适当调换物镜，降低数值孔径或放大倍数。
三、光路合轴和光阑调整
显微摄影采用中心亮视野透射照明法，照明光束中轴与显微镜的光轴在一直线上。光路系统始于光源，经视野光阑、孔径光阑、聚光镜、透明制片标本、物镜和目镜，将物体影象投射在暗箱的焦平面上。
摄影前，光路要合轴调整，光束与显微镜的光轴，位于同一轴线上。光路系统中的目镜、物镜和孔径光阑，于固定位置，勿需调整，仅聚光器可变。因此，光路的合轴，实为聚光器的调中。
摄影要求视野亮度非常均匀，调整光源灯位置，使之照明于视野中央。
当前，摄影和观察普遍采用科勒(Koehler)照明法，这是一种最佳的中心亮视野照明。
1、聚光器和光源灯的调中摄影前，要把聚光器和光源灯调中，使聚光器中心与视野光阑的中心处于同一光轴上。光源灯的灯丝，照明于视野中心。
聚光器的调中步骤：
（1）转动聚光器升降旋钮，把聚光器升至最高位置；
（2）接通光源灯的电源开关；
（3）将被摄的制片标本，放在载物台上，用4×或6.3×低倍物镜聚焦在样品上；
（4）缩小镜座上的视野光阑，在视野中可见边缘模糊的视野光阑图象(3-7)；
（5）微降聚光器，至视野光阑的图象清晰聚焦止(图3-8)；
（6）用聚光器两个调中螺杆推动聚光器，使缩小的视野光阑图象，调至视野中心(图3-9)；
（7）开放视野光阑，使多角形周边与视野边缘相接(图9-11)；
（8）反复缩放视野光阑数次，确认光阑中心和边缘与视野完全重合；
（9）使聚光器回复顶点位置。

要通过视野光阑，保证视野的照明强度和均一，必须进行灯丝的调中，使投射的光束和光轴合一，其调整方法如下：
光源灯泡拧紧在灯座上，固紧于灯室或镜座中，转动灯座或灯室上的垂直、水平调节螺丝，使灯丝调中，位于视野中心(图3-11)。灯丝的图象，可于两处观察：一是在视野光阑上面的滤色镜座上，放一毛玻璃或乳白滤色镜，用以观察灯丝象的位置，至调中止；二是在物镜的后焦面上，聚焦后，从镜筒中取下目镜，在物镜的后焦面上，可见到灯丝的清晰图象。两法当中，前法可取，简便易行。

   灯丝的调中，可结合科勒照明法一并进行。
2、科勒照明法科勒照明法是当今显微摄影的最佳照明法，视野照光均匀，被摄物体不受热，影象清晰。新近的显微镜，照明系统已按科勒法设计装置，使用时稍加调整即达到最佳照明状态。
科勒照明法是光源的灯丝在聚光器的孔径光阑上成象。因此，也就在物镜后焦面上成象。这样视野内照光均匀，不会烤焦被摄材料，极为有效的控制被照明的视场及其照明孔径。
视野的照明强度，用升降电压调节。
3、正确的使用光阑显微镜有两种可变光阑，孔径光阑和视野光阑。正确的调整和使用光阑是保证摄影质量的重要环节。
（1）孔径光阑的调节使用：孔径光阑与聚光镜是构成聚光器的两个重要部分。显微镜的性能主要决定于物镜的性能，而物镜的性能又决定于数值孔径。物镜的数值孔径与聚光镜的数值孔径相关，两者孔径相等时，物镜分辨力最高。聚光镜的数值孔径受孔径光阑控制，用孔径光阑的开放与收缩，调节聚光镜数值孔径的大小。
显微摄影不同于一般摄影，其最大的区别是影象反差小，焦深浅。这两点可随孔径光阑缩小而提高。孔径光阑小于物镜的数值孔径时，物象的分辨力和亮度降低，但影象反差和焦点深度提高，便影象更加清晰。所以，在不过多地降低分辨力的前提下，把孔径光阑调到所用物镜数值孔径的60－70％大小是比较合适的。例如，物镜的数值孔径为1.0，孔径光阑的数值调到0.6－0.7，所以，显微摄影时，缩小孔径光阑，尽管丧失少许的分辨力，却提高了影象反差、焦点深度和影象的清晰度。
孔径光阑的调节方法：当聚光器标有孔径的数字时，对准所需的值即妥，如果不具孔径光阑数值，在显微镜向标本聚焦后，从镜筒中取下目镜，在物镜的后透镜中可见孔径光阑影象。光阑缩小时，仅一见一亮点，逐渐开大光阑，亮孔扩大，直至需要的程度。当光阑缩小，视野亮度降低时，可适当提高电压增加照明强度。
（2）视野光阑的调节：视野光阑位于镜座之中，用以控制照明光束的直径，缩小视野光阑，光束直径小于孔径光阑，视野亮度不足，影象不清晰；视野光阑开大，光束直径超出孔径光阑，因光线过多，造成光线的乱反射，影响影象的清晰度。视野光阑的适宜大小，以光阑的边缘外切孔径或孔径光阑内接视野光阑为度(图3-13)。

总之，孔径光阑的调节，取决于所用物镜数值孔径。当两者相等，分辨力最高；孔径光阑小于物镜的数值孔径，影象反差和焦点深度增大。视野光阑随孔径光阑而变，总是外切孔径光阑。更换物镜，数值孔径改变，孔径光阑重新调整，视野光阑亦随之改变。
四、选用适宜的感光胶片
感光胶片类别多，性能相差甚大，不是每种胶片都适于显微摄影。了解胶片的各种性能试拍后择优选用。一经选定，不要轻易改换，以保持拍摄质量的稳定。胶片的性能是胶片中直接决定和影拍摄质量的因素，如感色性，感光度和反差系数等，要从这些质量因素中选用适宜的胶片。
1、感色性是指胶片对不同色光的敏感程度，这是胶片最主要的性能。根据感色性，可把黑白胶片分为色盲片、分色片和全色片等不同的片种。
色盲片：乳剂中除卤化银外未加入化学增感剂，只能感受可见光谱中的蓝紫两色，对其他各种色光不感受。感色范围为330nm-480nm的波长区(图3-14)。为一种低速感光片，银粒细，反差大，解象力高。适于黑白、蓝紫等色光影象的显微摄影，不能用以拍摄红、绿和黄等色的影象。胶片对这些色光不感受，在照片上呈黑灰一片，不能分辨。所以，用醋酸洋红和孚尔根反应的染色体标本，不能使用色盲片摄影，铁矾苏木精制片的标本可以使用色盲片。

分色片：感光乳剂中加入了黄绿增感色素，除感受蓝紫色外，对黄绿二色也能感受，对红橙色光仍不能感受，感受范围为波长300μm－600μm区段(图3-15乙)，除红橙色标本外，可广泛用于显微摄影，是一理想的显微摄影胶片，它不仅反差强，颗料细，并能记录出较多的亮度等级和较宽的感受范围。用醋酸洋红染色和孚尔根反应的标本，仍不能使用分色片拍摄。
全色片：乳剂中添加了公演增感色素，对可见光谱的各波段色光能全部感受，故称全色片，感色范围为330-700μm(图3-15丙)，共中对绿色光感应稍弱。胶片的银粒粗、感光速度快、反差小、黑白等级多。这些特点，会使显微摄影本来影象反差就小，黑白对比不鲜明的缺点更加突出。照片中的染色体不黑，背景不白，呈灰暗状态，使用感光底低(ASA50以下)的全色胶片，可获良好的效果。
2、感光度指胶片对光线作用的敏感程度，即感光速度。显微摄影对胶片的感光速度没有特写的要求，选用胶片时，考虑的不是速度本身，而是与感光速度相关的质量因素，凡属感光度高的胶片，乳剂的银粒粗、反差小、灰雾大、保存性差；感光速度低的胶片、银粒细、反差大、灰雾小，保存性好。所以，显微摄影力求使用低感光度的胶片，以便获得反差高、银粒细腻、清晰度高的摄影效果。目前，市场供应的GB21°(ASA50)全色胶片，不是理想的显微摄影用胶片，感光度在ASA100以下适于显微摄影。
3、反差和反差系数反差是指被摄物体景象中明亮部分与阴暗部分亮度差别的程度。胶片的反差，用反差系数表示。它是指胶片影象反差与被摄物体影象反差的比值。即：

若胶片上影象反差大于物体影象反差，则胶片的反差系数大于1；胶片影象反差小于物体影象反差时，胶片的反差系数小于1。同一视野的相同影象，用不同反差系数的胶片拍摄，能拍出不同反差效果的底片。反差系数愈大，底片的影象反差愈强，黑白对比愈分明；反差系数愈小，底片反差愈弱，色调灰暗，影象黑白对比不鲜明。显微摄影选用高反差系数，对控制影象的质量是十分重要的。应作为选用胶片的重要质量指标。
除上所述，胶片的有效期限、乳剂号、胶片牌号和制造厂家，也是选用胶片时，加以考虑的因素。
五、滤色镜的选用
滤色镜是显微摄影必备的光学滤光元件，利用滤色镜对色光选择吸收的原理，通过控制色光，突出或抑制影象在胶片上的感应，以期获得理想的照相底片。
黑白胶片的显微摄影，是把视野中的彩色影象，以黑白两色及其不同程度的灰色中间层次，将影象录在负片上。利用滤色镜控制照明光束的不同色光，调整影色的色调和反差，可拍出各种不同效果的底片，甚至拍出在反差和清晰度上优于原物体影象的底片。

   一束白光，色散后形成红、橙、黄、绿、青、蓝和紫七种单色光。这段可见光谱的波长为400-700μm，为实际应用的方便，通常将该七种色光概括为红、绿和蓝三段。白光就是由这三种色光等量混合组成。而红、绿和蓝色光的不等量混合，会形成各种不同的色光。
在摄影中，通常把红色光、绿色光和蓝色光称作三原色光。把蓝光与黄光、绿光与品红光、红光与青光称作三对互补色光，这三对互补色光分别相加皆可得到白光、黄、品红和青三色，就称为红，绿和蓝三原色的补色。
滤色镜对各种色光有选择吸收的特性，凡与滤色镜颜色相同的色光则能透过，而与滤色镜颜色互补的色光则被吸收。例如，绿滤色镜，在白光下把光谱中的蓝色光区段和红色光区段全部吸收，只让绿色光段的色光透过，滤色镜显示绿色。黄滤色镜吸收蓝色光，透过红光和绿色光。红滤色镜，把光谱中由绿到红段的光波全部吸收，只让红色的一段光透射。蓝滤色镜吸收了由红到绿段的色光，仅让红色的一段光透射，蓝色滤色镜吸收了由红到绿段的色光，仅使蓝色光通过(图3－15)。
在显微镜的光路上，加用滤色镜，从白光中减去与滤色镜颜色互补的色光，使改变的色光透射物体，造成影象色调和反差的改变。显微摄影利用滤色镜提高影象的反差和清晰度，以获得理想的底片，被摄物体反射出来的色光，如果被滤色镜透过，在黑白底片上产生相应的密度，印放出照片，这部分影调，比较明亮，假若该色光被滤色镜吸收，底片上的密度就薄，制出的照片影调就暗。
为提高影象反差，选用滤色镜的原则：选用与被摄物体吸收的色光同一颜色的滤色镜，即选用被摄物体的补色滤色镜，则可达到理想的最佳影象对比。因为视野中的物体影象的色调和反差，可被补色的滤色镜加强，而被同色的滤色镜所削弱。举例说明如下：
染色体用铁矾苏木精染色，呈蓝色，这种蓝色染色体，吸收红光和绿光，透过蓝光。摄影时加用蓝色的补色──黄色滤色镜，可把照明光线中的蓝色光吸收，通过的是黄色光，滤色镜透射的色光，恰好是染色体吸收的色光，致使透射在染色体上的黄色光全被吸收，不再作用在底片上。染色体在冲洗后的底片上呈白色，其他部分为黑色。印放照片，将是深黑色的染色体，散在光亮的白色背景上，影象清晰，黑白分明。
又如，在孚尔根反应中，染色体呈阳性，显品红色，非DNA部分不着色。拍摄时，加用品红色的补色──绿色滤色镜，它吸收红光和蓝光，透过绿光；品红色的染色体，透过红光和蓝光，吸收绿光，滤色镜透过的色光，恰是染色体所能吸收的色光，因而造成了最佳影象反差。
对双重染色的染色体标本，拍摄时选用突出重要影象的滤色镜。例如，用孚尔根反应外加固绿，染色体染成品红色，细胞质部分呈绿色。加用绿色滤色镜，则突出品红色，削弱绿色。
总之，显微摄影选用滤色镜，取决于染色体的染色。如果滤色镜只透染色标本所能吸收的光谱，或滤色镜的透射曲线与标本的吸收曲线相同，即选用补色的滤色镜，定会达到理想的最佳影象对比。
此外，尚须提及的一点：摄影时选用被摄体同色的滤色镜，可提高影象的分辨率。
滤色镜只限于用全色胶片拍摄时使用，不能到处滥用。对于只有黑白或灰色的物体影象，由于均匀的吸收或透射各种色光，滤色镜在此不起作用。
六、拍摄
拍摄是显微摄影系列操作中的关键环节，在镜检观察中，发现必须摄下的影象，应即时拍照。
拍摄前，做好系列的操作准备，具体方法已在前面述及。例如，摄影物镜和目镜的合理组合，光路合轴，科勒照明，合理加用滤色镜，调准孔径光阑和视野光阑以及应用低速全色胶片等。这些操作，彼此相关，缺一不同。然后转入取景、聚焦和曝光拍摄。
1、取景和聚焦显微摄影要通过摄影装置的侧视目镜取景器，对准拍摄的物体影象，选取适宜的物象进行拍照。
（1－）屈光度调节：取景聚焦前，首先进行屈光度调节，使目镜取景器适于各种不同视力者，达到准确的聚焦。在显微摄影装置的接头部位，有一则视目镜取景器(图3-16)，它由数片透镜组成，近眼端为屈光度调节环，能左右转动，变换透镜间距，改变焦点距离，调节环旋转调节的最大范围为±5屈光度(一屈光度相当于眼镜的100度)。经过调节，使近(远)视眼在500度以内的人，可脱下眼镜取景对焦。

双十字线校准后，要保持不变，不能随意变动，以防焦距改变。取景聚焦，只需使用显微镜调焦螺肇。屈光度调节，仅改变目镜取景器的长度，不涉及被摄物体至暗箱焦平面的距离，当十字被看成双线时，聚焦的影象焦点，能清晰地投射在焦平面上；如果十字线被看成单线，既使影象是最清楚的准焦，其焦点并不落在暗箱的焦平面上，而位其前后，底片影象模糊不清，当改变拍摄者或左右眼调换使用时，皆需重新进行屈光度调节。
（2）取景：取景决定拍摄的对象、范围和大小。专用摄影设备，用侧视目镜取景器取景，在刻有双十字线的玻璃屏上，同时刻有数种规格的长方形取景框(图3－18)。底片所能摄下的范围，并非视野所见的全部，仅是圆形视野中的长方形部分，在可供系列暗箱共同使用的取景器中，有数种规格的取景框，取景时要准确使用，务使报用暗箱的规格与取景框的大小相符。

   拍摄的物体一经确定后，即要考虑拍摄的范围和大小(放大倍数)。例如，拍摄减数分裂的同步性，为展示植物花粉母细胞在花药中同步地进行减数分裂，拍摄的范围应大，在一张底片上，要有足够数量的同步分裂的花粉母细胞，以数量突出同步性。这时选用低倍的物镜和目镜拍摄。作为染色体计数和组型分析的摄影，拍摄的范围要小，每片要拍全一个细胞的染色体，尽可能利用取景框所能提供的范围，提高放大倍数，使染色体民取景框相接。
取景时，要使被摄的物体影象中心位于长方形取景框的对角线中心，并使两者的长、短相应(图3－19)。需要90°调整时，转动载物面或摄影装置，让影象长轴和取景框横轴平行。影象的大小用调换物镜和目目镜控制。
（3）聚焦：转动显微镜的粗细调焦螺旋，改变物镜前透镜和被检物体的距离，使视野中物体影象的焦点聚于暗箱的焦平面上。
纵横移动镜台的制片标本，寻找拍摄的图象；上下转动调焦螺旋，辨清染色体的细微结构，取景聚焦，需几经反复，底片影象的清晰度决定于拍摄前的最终一次准焦。
取景聚焦完毕，立即揿下快门按钮，任何有关操作，都要在聚焦前完成。准焦的微小颤动，也会引起焦点的改变，致使拍出的底片影象模糊不清。使用135或120胶片拍摄，卷片在在聚焦前完成，尤其使用镜臂升降的显微镜更应注意。
加放滤色镜务在聚焦前置于镜架上，如在聚焦后加用，会使焦点改变，影象不清。
摄影暗箱的焦平面要与载物台平行，否则调焦后的影象，不会垂直地投射到胶片上，致使影象部分清晰，部分模糊。
拍摄有丝分裂中期染色体，要对准两个染色单体间的空隙部分聚焦；具各种分带的染色体，亦可对准带纹准焦。同一细胞内的各染色体，往往不易分散在同一水平上，多少有一个深度和或层次。对此，要聚焦在中层的染色体上，力争物镜和目镜所能予的有限的焦点深度，以期扩大清晰范围。当然，降低物镜的数值孔径，亦可提高焦点深度。
用4×或更低的物镜拍摄，由于焦点深度大，影象在很大的深度内都保持清晰，致使难以做到准确的聚焦。为此，要把聚焦望远镜装上目镜取景器上，借以聚焦。聚焦时，将望远镜的焦距调至无限远处，重新进行屈光度调节。待看清两条平行的十字线再转入调焦操作。
使用单张散页片暗箱摄影，先把暗箱拉盖抽出，稍待片刻，稳后聚焦。
2、曝光曝光是显微摄影技术上的关键。曝光最重要的问题就是判定曝光时间，确定曝光所用的快门速度。显微摄影的视野，亮度变化极大，曝光时间的变化辐度甚大。正确的估计曝光时间，比普通摄影要困难得多。常用的估计影象亮度来确定曝光时间的方法，往往因光强度的特大变化，人眼对光的强度不会有科学的定量能力，致使发生错误。
曝光过度，使底片密度很大，浑暗不清，没有透明的地方，丧失影纹细节；在最小密度部分灰雾密度大，底片反差小；曝光不足，整个底片密度很小，比较透明，虽然最大密度部分影纹分明，但最小密度和灰雾密度一样，没有影纹存在，缺乏正常的反差。这类底片，根本不能印放出合格的照片。
影响曝光的因素很多，其中包括：被摄物体的颜色和光学必须、物镜的数值孔径和倍数、目镜倍数、胶片的性能、滤色镜的颜色、光源强度和色温等因素。下面概述几个主要因素，除胶片感光速度是表示对亮度的敏感强度外，考虑其余因素的共同着眼点，就是分析它们对被摄影象的亮度是加强还是削弱。
（1）照明光源：光源灯是显微摄影的照明光源，它有数种，照明强度和色温各不相同。
低压钨丝白炽灯为常用的照明光源，灯泡很小，便于使用，灯丝聚成球状，颇似点光源，光线易会聚成束，强度较大。所用电压6-12V，功率5-60W，以6V15W的灯泡最常见。灯丝发出的光谱成分和光量，决定于它的色温，色温越高，发出的光量越大，光谱成分中蓝紫的比例增多。色温与电压有关，电压升高，光量愈大，色温提高，蓝紫光成分增多(图3-21)。6V15W灯泡较之12V60W灯泡，无论在色温和发光量上，都相差较大。显微摄影的曝光时间，按所用光源强度而定，电压高，功率大的灯泡，照明强度高，蓝紫光多，使胶片感光快，曝光时间要短。与其他光源相比，钨丝白炽灯的发光，红橙光多，蓝紫光少，所以灯光显黄色。发出的光为连续光谱，加上适当的滤色镜，可得到可见光谱中的任一单色光。

卤钨灯为一新型光源灯，发光效率高，照明强度大。灯泡小，石英玻璃外壳，发光灯丝近点状，色温在3000°K以上，发光稳定，比功率相同的钨丝白炽灯亮得多。胶片感光快，曝光时间要短。卤钨灯的光谱曲线也是连续光谱，常用12V50W和12V100W的灯泡。适于显微摄影照明用。
氙灯，亦属新型光源灯，是在充氙气的石英玻璃管内装上钨丝电极制成。显微摄影照明用的是一种短孤氙灯，为一种亮度极高的点光源。多采用20V150W的氙灯照明。氙灯也是连续光谱，在可见光区，各种波长能量大致相等，色温6000°K左右，近于日光的白光。适于显微摄影，尤其适于日光型彩色胶片摄影。
（2）胶片的感光度：目前，很多单位显微摄影所用的感光胶片，大多为ASA100(21DIN)的全色胶卷。胶卷的感光度直接影响曝光时间，ASA感光标准，其数值相差一倍时，胶片的感光时间也相应地相差一倍。例如，ASA100的胶片，正确的曝光时间为1/15秒，ASA50的胶片则曝光1／8秒，而ASA200的胶片只需曝光1／30秒。余类推。DIN制感光标准，每差三个数值，胶片感光时间相差一倍。如21°DIN胶片，正确的感光时间为1／15秒，24°DIN胶片只要曝光1/30秒，18°DIN的胶片要用1/8秒，我国的胶片感光标准“GB”制同于“DIN”制标准。使用胶片时要注意：同一感光度，不同牌号的胶卷，如“上海”GB21°胶卷与“南方”GB21°胶卷，其实际感光度不尽相同，既使同一牌号的胶卷，不同时期的产品(乳剂号不同)，在性能上会有稍许的差异，胶片超过有效期，或保存条件不佳，胶片的感光度会降低，使用时要酌情增加曝光时间。
（3）物镜的数值孔径和目镜的放大倍数：曝光时间取决于视野中的影象亮度，影象亮度与物镜、目镜的性能相关。物镜的数值孔径大，进光量多，影象亮度大，曝光时间要短；目镜放大倍数大，视野相对加大，影象的亮度相应的减小，曝光时间要长。总之，曝光时间与有效的物镜的数值孔径的平方成反比、与目镜的放大倍数的平方成正比。
（4）滤色镜的颜色：滤色镜具有滤光的作用，光源投射的光束，经滤色镜的选择吸收，仅有部分色光透射，减弱了光源的照明强度，其减弱的程度，因滤色镜不同而别。被滤色镜减弱的光强度，在摄影时必须给予补偿，以达正确的曝光。一般用滤色镜的因数表示，所谓因数就是用某种滤色镜后，应在曝光时间上增加的倍数或曝光补偿倍数。但是补偿的倍数不是固定不变的，因数可随条件不同而改变。例如，使用全色胶片拍摄，因对全部可见光的各种色光都感受，加用黄滤色镜，仅吸收蓝光，红光和绿色都可透过，所以因数小，即补偿倍数小，加用红滤色镜，吸收了绿光和蓝光，仅透过红光，滤色镜的因数大，即曝光补偿倍数大。同色滤色镜的因数亦不同。光源色温高，照明光线中蓝紫光多，加用黄滤色镜，吸收的色光多，因数大；光源色温低时，照明光线中红橙光多，蓝紫光少，黄滤色镜吸收的色光相对减少，所以因数小。
一般情况下，使用全色胶片时，黄滤色镜的因数小，蓝、绿和红滤色镜的因数大，适宜的曝光补偿倍数，要通过试拍解决。中黄滤色镜的补偿倍数为1－1.5左右，中绿滤色镜为2左右。
（5）被摄物体的染色和光学性质：视野中影象的染色和反射光情况，也是影响曝光的因素。染色体染色适度，分色好，清晰醒目，背景透明，反差大，曝光的宽容度大，易拍出感光适宜的好底片。染色过深，分色不好，染色体被染料堆积，微细部分辨不清，底色深，背景浑暗，通透性不好，曝光时间要长。染色浅淡，染色体不鲜明，与背景区别不大，反差小，曝光时间要短。后两类材料难以拍出好的底片，除非是奇缺，否则，应弃之不顾，不值得拍。
被拍物体染成蓝紫色，较之其他染色，易拍出好的底片。红、黄和绿，因胶片对其敏感性较差，难以拍出理想的底片。
总括上述诸因素，决定出准确曝光的快门速度。调准速度后，边取景聚焦，边持快门线，待准焦后，立即揿动快门按钮，快门开启胶片感光。曝光时严防振动，按动快门，不要用力过猛，低速曝光的轻微颤动，也会使底片上的影象模糊不清。
目前，从摄影设备的设计制造上，已能完全保证准确曝光。如在光电元件控制下的自动曝光或用曝光表测定后的曝光，都可拍出感光准确的底片。但是，由于设备的限制，当前尚不能普遍采用，大量地还是手工操作的摄影装置。在完全手控条件下，只要多拍，精心钻研，长期地记录对比，达到正确的曝光是不难的。因此，严格控制光源的电压，使照明强度保持相对稳定状态，在一定的物镜、目镜组合下，调节使用与之相应的光阑开度，科学地运用滤色镜，保持使用同一种胶片，并能熟练地掌握显影技术，就一定能拍出理想的底片。