显微镜的七种观察方式 +* F e
一、明视野观察（Bright field） ao0^;
明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式，广泛应用于病理、检验，用于观察被染色的切片，所有显微镜均能完成此功能。 K2\ )9
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二、暗视野观察（Dark field） Wsp c ;]&
暗视野实际是暗场照明发。它的特点和明视野不同，不直接观察到照明的光线，而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此，视场成为黑暗的背景，而被检物体则呈现明亮的象。 ^O =G%de
暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现象，微尘在强光直射通过的情况下，人眼不能观察，这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它，由于光的反射，微粒似乎增大了体积，为人眼可见。 )#GF:.B
m.. 暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体，而是将光线改变途径，使其斜射向被检物体，使照明光线不直接进入物镜，利用被检物体表面反射或衍射光形成的明亮图象。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察，最高达0.02—0.004 8GRB6 -.h
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三、相差镜检法（Phase contrast） ji\&?% (B
在光学显微镜的发展过程中，相差镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本. zk!7TUZ">w
相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜。 eh>FYx(
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相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： .LDp.#d9r1
1. 环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 ;q5|If
2. 相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种： 6n JQP a
1. A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 +sTPTCLE
2. B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗 ~g% Ht# <
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四、微分干涉称镜检术（Differential interference contrast DIC） @h_ bXo
微分干涉镜检术出现于60年代，它不仅能观察无色透明的物体，而且图象呈现出浮雕壮的立体感，并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点，观察效果更为逼真。 }D?qj3?bj
原理； \rATmjsKzS
微分干涉称镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉。 uJlW$Oc:.
DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了偌玛斯斯棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个偌玛斯斯棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕 Q, "8Ty
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五、偏光显微镜（Polarizing microscope ） 8^D1u`
偏光显微镜的特点 xX 9snSGz
偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色发来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。 n(|n=P:o
偏光显微镜的特点，就是将普通改变为偏光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。 QC!SgV
双折射性是晶体的基本特性。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物，化学等领域。在生物学和植物学也有应用。 1G67#L)USq
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六、浮雕相衬显微镜（RC） Fa\jVFIQ
1975年，Robert Hoffman 博士发明 WbBd<^Q
2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品 FzP1b_i
原理 -j2y#aP
斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度 6|{&7=1t
特点 C@\5%~tW+
提高未染色标本的可见性和对比度； .)Pul|)d
图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕； #, #:{&H
可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ； KF5r?|8 M
可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织； @HSK[[?
聚光镜的工作距离可以设计的更长； XN>bv|*q
RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察 -'L~Y~'.
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七、荧光显微镜（Fluorescence Microscopy） }N ).$
荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体，使之受激发后而产生长波长的荧光，然后观察。 ].5q,A]
优点： `u
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• 检出能力高（放大作用） ,c0LRO
• 对细胞的刺激小（可以活体染色） `@WJ_-$#
• 能进行多重染色 $duT'G, -
用途： IbJl/N %o
• 物体构造的观察——荧光素 j_~mP>el)
• 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等 Bd)Cijr
• 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
