分光光度计 NFv> B>
u(G*\<z-
一、概述 9?k_y ZV
分光光度计是利用物质对光的选择吸收现象，进行物质的定性和定量分析的光电式分析仪器，也是一种光谱仪器。根据电磁辐射原理，不同的物质具有不同的选择吸收，也即具有不同的吸收光谱。通过对吸收光谱的分析可方便的判断物质的内部结构和化学组成。随着工业生产和科学技术的不断发展，以及人们对物质认识的不断深化，，迫切要求发展新的先进的分析技术和仪器，分光光度计就是在这种历史条件下问世和发展的。 q:g2Zc'Y~W
分光光度计是分光仪器和光度计的一种组合。按工作光谱原理的不同，分光光度计可分为研究物质分子吸收光谱的分光光度计、研究物质中原子吸收的原子吸收分光光度计、研究物质分子荧光发射的荧光分光光度计和研究物质原子荧光发射的原子荧光分光光度汁、研究分子喇曼散射光谱的喇曼光谱仪等。由于分光光度法具有分析精度高、测量范围广、分析速度快、样品用量少等优点，分光光度计已成为探索自然、改造自然、发展科学技术和生产的强有力的工具，是现代化分析实验室必备的常规仪器之一。 W6Y@U$P#G
二、分光光度计的基本组成 )+fh-Ui
分光光度计主要构成部分有光源部分、光度计部分、单色器和接受记录部分。分光光度计的主要组成部分可以用图1表示： cv`~y'?D
光源 I|Gp$ uq _
单色仪 x#:| }pR
样品池 "Iix
)Ue
接受放大系统 Q%f|~Kl-hd
显示记录系统 LW(6$hpPp
?R$&Xe!5
TjG4`:*y#m
图1 分光光度计框图 Fgh]KQ/5
下面分别叙述这几个部分的光学系统的特性。 5scEc,JCi
1光源系统 N;[>,0&z
分光光度计的光源系统由光源和照明系统组成。 N\bocMc,X
1.1光源 >]c*'~G&
分光光度计中对光源有一定要求，理想的辐射光源应具备以下一些特性： /soKucN"h
(1)在所使用的被长范围内提供连续辐射，即光源应发射连 ,GgAsj: K
(2)辐射能量随波长的变化尽可能小，且有足够的强度。 e#k<d-sf6
(3)使用寿命较长。 wm^J;<T[
(4)要有良好的稳定性，特别是对单光束仪器。 |n] d34E
在190一360nm波长范围紫外波段，常用的光源是氢弧灯和氘弧灯，氘灯的紫外光发射强度比氢灯强。 nWHa .H#
在360一2500nm波长范围可见和进红外波段，常用白炽钨灯作为光源。图2为氢灯、钨灯的光谱能量分布图。 FLY
Ca
在2—50μm波长的中远红外波段内，常用的光源是能斯脱和硅碳棒，其光谱能量分布如图3所示。另外，对于要求较低的仪器，灼热的金属丝(如镍铬丝)可以作为红外光源；而在远红外区高压汞灯也是一种常用的光源。 3*@5S]]
图2 光源能量分布 图3 红外辐射光源 h5K $mA5
A－氢灯，B一钨灯，C一不同温度T的黑体辐射 A－能斯脱，B－硅碳棒 JwXT%op9RP
1.2照明系统 }RP @!=
光源系统的照明系统一般有两中：单光束照明系统和双光束照明系统。光源系统中的反射镜的作用是把光源发出的光线集中在单色 s8h-,@p
器的入缝上，使整个狭缝照明均匀并充满单色器的孔径。 }m-FGk
在照明系统为单光束的仪器，只要求光源反射镜引入一个高通量的光束即可，对光源的成像质量要求不高。图4为一种单光束照明系统光路图。 plZ>0 3(6Q
在双光束照明系统的分光光度计中，光源系统并不直接照明单色仪的狭缝，如图5所示。光度系统处于单色器和光源之间，而在光度系统中，有一个梳形减光楔，光源必须首先成像在减光楔上。减光楔通过光度系统要求清晰地成像在单色器的入缝上。 Exk\8,EGqS
/S lYm-uQ+
图4单光束照明系统 图5双光束照明系统 uDZT_c'Y
2单色器系统 9 '2_
单色器是分光光度计的核心部分，仪器的主要光学特性和工作特性基本上由单色器决定。它的作用是将光源发出的白光色散成各种波长的单色光，从出射狭缝中导出，照于样品上。分光光度计中的单色器是一个完整的色散系统，除了色散元件——棱镜或光栅外，还有入射和出射狭缝以及一组反射镜。根据工作光谱范围、色散率、分辨串等性能指标的要求，可分别选用棱镜或光栅分光的单色器，双联单色器，也可采用滤色片分光的单色器等。 )[Yv?>ib
2.1虑光片 /g4f`$a
滤光片是最简单、最廉价的单色装置。由于它的单色性不好，使测定精度大大受到限制。它的特性可以用最大透光波长(或称中心波长)和谱带半宽度(有效带宽)来表征。最大透光波长是指在此波长光源的辐射最强。有效带宽是指最大透光度值的一半处的谱带宽度。在分光光度计中，滤光片一般用来消除单色器的杂散光。滤光片可分为五种：中性滤光片，截止滤光片，通带滤光片，干涉滤光片以及校正滤光片(标准滤光片)。 c?@T 1h4
2.2单色器 & :7ZQ1
从波长范围宽广的光源辐射中分出波长单一的单色光的光学装置称为单色器。单色器是由入射狭绕、准直元件、色散元件(常用核能或光栅)、和出射狭绕组成。 r4#o+qE
棱镜可以作为从紫外到中红外区的合适的色散元件。在紫外范围，常用的材料是硅、矾土和人造蓝宝石。矾土和人造蓝宝石能用于200到4000nm，但昂贵，所以常用熔融石英作棱镜材料。在可见范围，硅的色散次于光学玻璃，所以可见分光光度计常用廉价的光学玻璃作棱镜材科。玻璃和石英棱镜担色器的色散特性模式图见图6。为了便于比较，将显示线性色散的光栅单色器的色散特性也列在一起． ?)#5X_V-q
图6 三种材料单色器的色散特性 { . ?/)
棱镜单色器的光谱纯度主要决定于棱镜的色散特性和光学设计。通常使用两种形式的棱镜单色器——本生(Bunsen)单色器和利特罗(Littrow)单色器。 2J;kSh1,L
光栅是一种十分重要、应用范围很广的色散元件，可以用于紫外、可见、近红外范围的色散。光栅分透射光栅和反射光栅。透射光栅是在一块玻璃上或其它透明材料上刻一系列平行的和紧紧相靠的凹槽。生产这样的母光栅需要精密的装置，比较昂贵。复制光栅比较便宜，虽在性能上次于母光栅，但能满足应用。反射光栅是在复制光栅的表面上喷涂铝的薄膜制成的。也可在抛光的玻璃表面或金属表面镀铝，然后在铝表面上刻大量的平行线制成的。光栅的刻线越多，分辨率越高，每单位长度的刻线越多，它的色散就越大。闪耀波长是闪耀光栅的另一个重要的参数，在闪耀波长，光栅有最大能量输出。光栅的主要缺点是有次级光谱干扰分析，且杂散光的影响比棱镜更大，故常配虑光片以去除杂散光。棱镜的主要缺点是色散波长的非线性分布。 Z@$8I{}G
光栅单色器有几种排列方式，通常用的一种是埃伯特（Ebert)式（图7），是埃伯特1889年发明的。它用一个球面镜准直和聚焦，并对称地放置两个狭缝，波长选择是通过旋转光栅实现的。后来采尼(Czerny)和特纳(Turner)对其进行了改进，用两个小的球面镜来代替大而昂贵的埃伯特球面镜（如图8），使得结构紧凑，后为现代仪器所常采用。 R`~z0 d.
图7 埃伯特衍射光栅单色器 图8采尼和特纳衍射光栅单色器 jt.3P
入射和出射狭缝 _hk.2FV:3m
狭缝是单色器的重要组成部分之一，关系到分辨率的优劣。它是由具有很锐刀口的两片金属片精密加工制成的。刀口相互之间是严格平行的，并且是在相同的平面上。狭缝宽度有两种表示方法，一是用狭缝的两刀口之间的实际宽度表示，单位是毫米（mm）；另一是用从单色器出来的有效带宽表示，单位是纳米（nm），通常用后者表示。 a.zpp' cEb
3光度系统 7!N2-6GV
紫外可见和近红外分光光度计的光度系统分为单光束和双光束两种。 ~B(6+~%
3.1单光束的光度系统 WH \)) y-
单光束的光度系统简单，如图9所示。此系统在采用比较法测量样品的光谱透过率或反射率时，通常有两种方式： #KiRfx4G
图9 单光束的光度系统 eD#hpl
方式1：在整个工作波段测定完标准后，再测样品，得出的结果进行比较。此方式的缺点：波长的重复性不高，这是由于两次测量标被及样品的时间间隔长，光源的不稳定，波长的重复性、接收系统的不稳定等因素造成的。 zO
MA
方式2：在待测的每一波长处标准和样品依次快速地替换，分别进行测量，进行比较。此方式的优点是严格保持标准和样品完全相同的照明及测试条件，但却使样品和标准不断地处于运动状态，因此采用较小。现代的自动分光光度计多采用双光束法来实现比较测量。 lO_UPC\@fw
3.2双光束的光度系统 IOV(seEY
双光束光度系统的显著的特点和最基本要求是保持光路对称。即两光路中的反射次数和相应的反射角、透射次数和相应透射面的曲率以及射入接收器的角度和照射面积等，尽量要求做到对称，并且光路应尽量缩短，光学零件也应尽量减少。 Dmu/RD5X:
图10所示是在紫外——可见和近红外分光光度计中常用的双光束光度系统。 AoI /n4T^
图10 紫外—可见和近红外分光光度计中常用的双光束光度系统 mOlI#5H
红外分光光度计中光学系统的基本要求与紫外一可见分光光度计相同。但在光学平衡法测定中，应用减光器Wl改变参考光束的强度来实现零点平衡。为了校正仪器的100％透过率，在样品光路中设有减光器W2。图11为红外分光光度计的光度系统图。 }_68j8`
图11 对称式红外分光光度计光度系统 LoGVwRmoC
4接受放大系统 r#B+(X7LM
接收部分的光学系统要求能把单色器出射的光束全部会聚到接收器的靶面上，使光信号全部转换成电信号。 }O4^Cc6
按其探测机理不同，可将分光光度计中常用的辐射接收器分为光电接收器及热电接收器二种。 TG5XSy
4.1光电接收器 .>IhN 5
常用的光电接收元件有光电倍增管、光敏电阻和光电池。 I'0@viF"Nx
光电倍增管是利用外光电效应与多级二次发射体相结合而制成的光电器件。前者作为电子产生的元件，后者作为电子放大元件，其积分灵敏度远远超过充气光电管，而且它又与真空光电管一样有很好的线性关系，是紫外和可见区的极灵敏的探测元件，目前应用很广。 =%BZ9,l
室温下的光敏电阻结构简单、体积小。但是它的光谱灵敏范围很窄，选择性较强。在分光光度计中，只有在0.7—3.5μm的波段内是采用硫化铅光敏电阻。 E\4 +_L_j
光电池是利用半导体材料受外界辅照时形成电势差的大小与入射通量的强弱成一定比例来进行光电检测的。光电池的积分灵敏度比光电管大100多倍，主要用于可见光谱区和近红外光谱区。 6}oXP_0U
4.2热电接收器 (#E.`e1#6
将热能直接或间接转变成电能的接收器称为热电接收器。在光谱仪器中应用最广泛的热电接收器有真空热电偶、高莱探测器和热释电探测器等。表1列出了几种热电接收器的主要性能及工作参数。 SE~[bT
fw RZ5`v<
q+ vx_4
5>\/[I/!
表1 几种红外热电接收器的主要性能 }x
wu*Zx
红外热电接收器 #gcF"L| |
类型 灵敏度/ x HhN
(V/W) 时间常数/s 接受面积/mm2 E3iW-B8u8
真空热电偶 2 3×10－2 2×0.2 L~NbdaO
测热辐射计 3700 2×10－2 1×1 n;T7= 1_"
高莱池 2×105 1．5×10-2 7 6ZQwBS0Y
热释电探测器 3×103 4×10-2 5 r|qp3x
~7zGI\= P@
样品和标准的光度信号进行双光束的比较法测量时，光电信号处理方式分为光学零位平衡法和电学比例记录法两大类。 Sh8"F@P8
4.3光学零位平衡法测量 d $Pab*
图12所示为一种红外分光光度计光学零位平衡法测量原理图。 YS%h^>I^
图12 光学零位平衡法测量原理图 +qw jbA+
从光源S发出的红外光辐射被两块相同的反射镜M1和M2分成对称的两束光束．经M3和M4聚焦于两个试样池C1和C2的中心。由于放在C1和C2中的待测试祥和参考试祥具有不同的光吸收特性，两束透射光的强度不同，因而最终通过滤光片F到达探测器热电偶B0上的光能量不同，热电偶输出的交变光电信号与两束光的强度差别相应。信号经电子系统放大、检波、滤波、伺服放大后，变成伺服电动机的驱动信号，由它带动参考光束中的光楔W移动。光楔上具有若干条楔形通光缝隙，其通光面积随其与光束的相对位置变化而变化。因此，光楔在参考光束中作垂直光轴方向移动时，透过光楔的光能量随之变化。若光楔在伺服电动机带动下移动到某一瞬间位置、透过光楔的参考光束强度正好与待测试祥吸收后的测定光束强度相等，即两光束强度差等于零时，两光束平衡，热电偶B0的输出也等于零，伺服电动机不再转动，光楔停止移动。放在试样光束中的另一个光楔W‘是用于调整双光束对称性的，不参与试样光谱的测定过程。通过技术机将光楔W的垂直移动、对应的波长记录下来，进而转化成待测样品的波长－透过率曲线。 `u&Zrdr ,
这种方法的优点：自动消除光源发射不稳定性、探测器灵敏度变化、电子放大系统零点漂移和增益系数波动等因素对检测结果的影响，提高测试精度和测试数据的再现性。其缺点是：响应速度不高，对变化极快的光电信号有滞后和畸变；对高吸收试样，测定精度低、数据可靠性差。 5qP :/*+
4.4电学比例记录法测量 %GS(:]{ n
电学比例记录法测量仪器中，不用减光楔控制参考光束的强度去达到双光束的强度平衡，而是分别地直接测出试样光束和参考光束的强度，然后经过电子学系统处理，求得两者的比率，记录待测试样相对于参考试样的吸收率变化曲线。 M L>[^F
为把试祥信号与参考信号分离开，不同的仪器采用不同的方法：有的采用两个转速不同的调制盘(斩光器)分别置于试样和参考光束中，使两束光形成的光电信号受到不同频率的调制，然后由电子系统进行鉴频检出；也有些仪器只采用一个调制盘，但采用同步信号线路，根据两个光束相应的同步开关信号分时解调出试样信号和参考信号，然后再作比例记录。 <h'5cO
图13是一种电学比例记录法测量原理图。 a,WICv0E
图13 电学比例记录法测量原理图
#c66)
装在调制盘一侧的同步信号发生器(电灯泡、调制盘上的小孔、光敏二极管组成)可给出相应的同步开关信号。透过参考池和试祥池的光束由探测器(在短于700nm的波长区采用光电倍增管B、波长大于700nm时改用Pbs光敏电阻)变成相应的参考信号R及和试样信号S。馈送到前置放大器的两种信号经放大后分别经过100％控制电位器和100％线补偿单元输送到试样放大解调线路和参考放大解调线路。这两个放大解调线路同时还接收同步信号发生器一方波发生器送来的位相相反的同步方波信号，使试祥放大解调线路的输出只包含试样光束强度变化信号、参考放大解调线路的输出只包含参考光束强度变化信号。两个已被分离的信号经量程变换线路后送到比例记录系统进行运算和记录，经计算机处理得到测试样的透射率(或吸光度)曲线。 [a
wjio
三分光光度计的主要性能指标及其检查方法 &Ob!4+v/GP
分光光度计的主要性能指标一般包括以下几项：波长范围、波长准确度、波长重复性、谱带半宽度、杂散光、分辨率、光度准确度、光度计线性、光度计重复性、噪音、基线稳定性。 8 {X"h#
3.1波长范围 j_. 5r&w
波长范围是指仪器上、下限波长之间的工作范围，是与光源、单色器及探测器的光谱响应特性有关的。有的仪器在波长范围两端缺乏足够的能量，不能正常工作，表现为100％T或0A设定困难，基线两端不平直等。 c>)Yt^ q&K
3.2波长准确度 Aw5HF34J
波长准确度是指仪器波长指示器上所指示的波长值与仪器出射的实际波长值之间的符合程度，可用二者之差(即波长误差)来衡量其准确性。 M%kO7>h8
常用的检查方法有：(1)用氘灯(或氢灯)的辉线检查；(2)用汞灯的辉线检查；(3)用标准玻璃虑光片检查；(4)用样品溶液的吸收光谱检查。 G8Y<1%`<
3.3波长重复性 {R? U.eJW
用一个已知样品吸收峰或灯的辉线作标准，在相同条件下多次重复读取峰位。计算每次观察的波长对平均值的偏差，这些偏差的平均值就是此分光光度计的波长重复性
ftF@Wq1f
3.4 谱带半宽度 n@,G8=J?
谱带半宽度又称有效带宽。这里是指离开单色器的出射狭缝的辐射光谱的峰高的一半处的谱带宽度。光源辉线或锐的吸收光谱都可用于谱带半宽度的检查。 rMhB9zB1
3.5杂散光 L>R P-x>
杂散光是指由检测器接收到的任何内仪器单色器分离的光谱范围以外的辐射。分光光度计杂散光强度的测量，通常采用在规定波长下几乎完全不透明的溶液或滤光片插入仪器，检测仪器给出的透射率值。紫外区可用NaI溶液测定波长为220nm处的杂散光，在可见区可用各种有色玻璃截止虑光片。 EpX&R,Rxk
3.6分辨率 [ S>2ASj
分辨率是指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，是衡量分光光度计性能的重要指标之一。单色器输出的单色光的光谱纯度、强度以及检测器的光谱灵敏度等是影响仪器分辨牢的主要因素。 _zw G\I|Q
分辨率的测试方法有许多种，这些方法的原理都是观察刚可分辨的最小波长间隔，在不同被长范围使用的材料及方法皆不同。 %s(k_|G+4
3.7光度准确度
N#a$t&
光度准确度是指仪器在吸收峰值上读出的透光度(或吸光度)与已知真实透光度之间的偏差。要测得正确可靠的数据取决于以下几方面因素：(1)样品质量，(2)制样技术，(3)仪器的性能和操作条件的选择，(4)吸收池的质量。由此可见，光度误差是一个综合性的误差。为了检定光度准确性，必须有一定的标准样品，现已有许多测试方法和参考标准供参考，一类是标准溶液法，另一类是滤光片法。 d5gR"ja
3. 8光度计线性 vz7J-CH
优质的光度计线性是用这个分光光度计测量时，对遵守比尔定律的溶液能给出一个吸光皮对浓度(A对C)的线性曲线。检查光度计线性可用溶液稀释起、吸收池光径法、中性虑光片叠加法。 q;][5
3.9光度计重复性 hj.a&%
光度计重复性是在相同的仪器上，相同条件下对同一样品进行多次重复测定（透光度或吸光度）。计算每次读数对平均值的偏差和这些偏差的平均值。 8;+B*+%@n
3.10噪音 j4uvS!
噪音是信号随时间而无规则的变化。噪音测量的方法是在仪器预热稳定后，在一定波长和一定缝宽下，扫描100％线或0％线数分钟，量取峰－峰之间的值作为绝对噪音水平。但在实际测定中，常用信噪比来描述仪器的性能，如在100％线扫描时，噪音是1％，则信噪比为100：1。 <,e+
kL{
3.11基线稳定性 io{@^1ab
基线稳定性是指双光束分光光度计在扫描100％线或OA线时(样品室中不放任何东西)读数随时间偏离的程度。如果基线稳定性不好，当然会影响光度准确度。 EKsT~SS
3.12基线平直性 m~-K[+ya`D
基线平直性是指双光束分光光度计扫描基线(100％线或0A线)(样品室中不放任何东西)时，基线倾斜弯曲的程度，它是仪器的重要性能指标之一。
