当紫外光照射某一物质时，该物质会在极短的时间内，发射出较照射波长为长的光。而当紫外光停止照射时，这种光也随之很快消失，这种光称为荧光。荧光是一种光致发光现象。如前所述，分子吸收了某一波长区的辐射能后，它的电子可跃迁至激发态，然后以热能形式将这一部分能量释放出来，本身又恢复到基态。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，即为光至发光。再发射的波长与分子所吸收的波长可以相同，也可以不同。物质所吸收光的波长和发射的荧光波长与物质分子结构有密切关系。同一种分子结构的物质，用同一波长的激发光照射，可发射相同波长的荧光，但其所发射的荧光强度随着该物质浓度的增大而增强。利用这些性质对物质进行定性和定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称为荧光分光光度法。这种方法具较高的选择性及灵敏度，试样量少，操作简单，且能提供比较多的物理参数，现已成为生化分析和研究的常用手段。 w3a`G|
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1. 荧光的产生及其与分子结构的关系： .\7R/cP}{A
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1) 荧光的产生： d/k&f5
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当光进入某种物质后，可以有两种情况：一种是进入物质后，能量几乎不被吸收；另一种是能量被全部或部分吸收。在后一种情况下，在吸收光的过程中，光能被转移给分子。根据量子理论，分子从光波中吸收能量是不连续的、整份单位的形式发生，这些不连续的微小能量单位被称为光量子。这也就是说，频率n的单色光的能量必定是hn的整数倍。每个光量子的能量 5#p [Q _
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E=hn=hc/λ=hcω, lBvQ?CJ<y
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这里，h为普朗克常数，6.63×10－34J/s；ω为波长，即1cm长度中电磁波的数目。从公式可见，能量E与λ成反比。 WJ9Jj69
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每个分子具有一系列分子的能级，处于基态的分子吸收了相应频率的能量后，可以从低能级跃迁到高能级。被吸收的光量子的能量正好等于两个能级之差。 /lC n^E6-
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根据玻尔兹曼分布，分子在室温时基本上处于电子的基态。吸收了紫外－可见光后，基态电子只能跃迁到单线激发态的各个不同的震动能级。跃迁后能量较大的激发态分子，在很短时间内（10—15s），由于分子间的碰撞或分子与晶格间的相互作用，以热能形式或内转换方式消耗部分能量，从较高震动能级回到最低震动能级。如果这时分子不通过热能或内转换形式来消耗能量，回到基态，而是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个不同震动能级时，就发射荧光。由于在发射荧光前已有一部分能量消耗，所以发射荧光能量要比吸收紫外光的能量小，也就是荧光的特征波长比吸收的特征波长要长。 Y? = +A4 v
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2) 荧光与分子结构的关系： qY]IX9'kV
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在许多有机物和无机物中，只有小部分物质会发生强的荧光，它们的激发光谱、发射光谱及荧光强度与它们的结构有密切的关系。强荧光物质在分子结构上往往具有如下特征： ~M6Q8Y9
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a. 具有大的共轭π键结构：共轭体系越大，离域π电子越容易激发，越容易产生荧光。大部分荧光物质都有芳香环或杂环。芳香环越大，其荧光峰移向波长方向，且荧光强度也往往较强。具有相同共轭环数的芳香族化合物，线性环结构者的荧光波长比非线性者长。 #qi@I;;t
b. 具有刚性平面结构：荧光量子产率高的荧光物质，其分子多为平面构型，并具有一定的刚性。 Z)Nl\e& M
c. 具有最低的单线电子激发态S1为π，π1型。 j)?I]j/
d. 取代基团为给电子取代基。芳香烃及杂环化合物的荧光光谱和荧光量子产率常随取代基的变化而变化。若取代基为给电子取代基，则荧光强度增加。属于这一类基团的有—NH2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN。 B9`nV.a
2. 荧光分光光度计： =P\H}?PF
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荧光分析从入射光的直角方向、黑背景下检测样品的发光信号，这与紫外分光光度法从入射光方向、在亮背景下检测光吸收信号相比，具有更高的灵敏度。此外荧光分析在检测器前面是发射单色器，样品信号经过分光后可以去除样品以外的辐射，从而为方法的专一性提供了有力的条件。 V
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用于测量荧光的仪器种类很多，如荧光分析灯、荧光光度计、荧光分光光度计及测量荧光偏振的装置等。其中实验室里常用的是荧光分光光度计。 -z)I;R
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荧光分光光度计的结构包括五个基本部分： D0/ \
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1) 激光光源：用来激发样品中荧光分子产生荧光。常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等，目前荧光分光光度计以用氘灯为多。 C S"2Sd 1`
2) 单色器：用来分离出所需要的单色光。仪器中具有两个单色器：一是激发单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。 9]r6V
3) 样品池：放置测试样品，都用石英做成。 Gdq _T*
4) 检测器：作用是接受光信号，并将其转变为电信号。 bm*Ell\a.
5) 记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示和打印。 :PuJF`k
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3. 荧光分析法： } :P/eY
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荧光分析方法根据不同的目的性，有多种分析方法，诸如同步荧光测定、三维荧光光谱技术、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辩荧光测定、荧光偏振测定、低温荧光测定、荧光免疫检测等等，各种不同的分析方法在仪器配置上常需要添加相应的配件。这些方法在此不作详细叙述，只讨论常规的荧光分析法。 tJy6\~
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1) 直接测定法和间接测定法： *D! $gfa
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利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测定法。某些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度。 J)D/w[w
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有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低仅能显现非常微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法。 lPFT)>(+@
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间接测定方法有以下几种： TXD\i Dq
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a. 化学转化法： 通过化学反应将非荧光物质转变为适合于测定的荧光物质。例如，金属离子与螯合剂反应生成具有荧光的螯合物。有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。 %?1k}(qUeY
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b. 荧光淬灭法： 这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质所具有使某种荧光化合物的荧光淬灭的能力，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接的测定该物质的浓度。 f5<qF ]Y/
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c. 敏化发光法： 对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太微弱而无法检测。在此种情况下，可使用一种物质（敏化剂）以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。 jXB<"bw
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以上三种方法均为相对测定方法，在实验时须采用某种标准进行比较。 Q"n|<!DN
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2) 多组分混合物定量法： (Vnv"= (
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在荧光分析中，由于每种荧光化合物具有各自的荧光激发光谱和发射光谱，因而在测定时相应的有激发波长和发射波长两种参数可供选择，这在混合物的测定方面比分光光度法具有更有利的条件。 gF+Uj( d
当混合物中各个组分的荧光峰相距很远，彼此干扰很小时，可分别在不同的发射波长测定各组分的荧光强度。若混合物中各组分的荧光峰很靠近，彼此严重重叠，但他们的激发光谱却有显著的差别，这时可选择不同的激发波长进行测定。 */fmy|#
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在选择激发波长及发射波长之后，仍无法达到混合物中各组分的分别测定时，则可利用荧光强度的加和性质，在适宜的荧光波长处，测得混合物的荧光强度，再根据被测组分各自在该波长下的最大荧光强度，仿照分光光度法列出联立方程，求得各组分的含量。
