显微镜物镜的光学特性介绍

今天和大家谈谈显微镜当中最重要的部件：物镜。为什么是最重要且没有之一呢？因为科研工作者们关心的解析度、信噪比等与成像质量息息相关的参数都是由物镜决定的。当然，显微镜的其他部分也一样不可或缺，但是篇幅有限，即便是物镜，我们也只能浅尝辄止的谈一谈。

在生命科学研究领域，光学显微镜的使用率绝对位列仪器的前三甲，如果有人不相信，那请看看周围吧，不管是在实验室，还是在医院，我们都随处可见显微镜们靓丽的身影。
而随着科学技术的不断进步，在光学显微镜的基础上，衍生出许多其他复杂的成像系统。例如全内反射荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子激光扫描显微镜等等。绝大多数的科研工作者们，都需要或多或少的和显微镜大家族中的成员们打交道。这个时候，对这些复杂系统的了解就有一些迫切了。
那么作为物镜当中，最不可不谈的东西就是物镜的最重要的参数：数值孔径。

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数值孔径即Numerical Aperture 所以在中国我们通常称之为NA值，NA值的大小直接标注在物镜上，大家平时切换物镜的时候，有观察过吗？通常来说NA值越大，物镜的成像质量越好。为什么会这么说呢？我们先来看看数值孔径的计算公式：
NA = n (sin μ)
其中n是物镜与样本之间介质的折射系数，μ是物镜孔径角的一半。
作为生命科学领域的研究者，我们不必去深究为什么NA的公式是如上所示，但是，我们需要了解的是为什么NA值是物镜最重要的参数，所以趁热打铁，我们再看看下面两个公式：
R= 1.22λ / [NAObj + NACon]
R = 1.22 • λ/(2 • NA)
上面两个公式的左边R，决定了物镜的分辨率，即物镜可以区分两点间的最短距离。接着我们再看看公式的右边，λ是入射光的波长，实验条件恒定的情况下，跟数值一样都是定制，而我们看到NA都是处在分母的位置上，即NA值越大，R的数值就越小，分辨率就越高，所以我们观察样本的解析度就越高，通俗点来说，就是可放大的倍率越大。那么为什么会两个公式呢？因为第一个是透射光的计算公式，另一个是反射光的。顺带一提的是，通常来说NACon即聚光镜的数值孔径要小于高倍物镜的数值孔径，所以荧光成像的分辨率要高于明场成像。
谈到反射光，作为现如今最重要的成像手段，荧光成像在显微成像领域毋庸置疑的处在垄断地位，这里笔者不得不多谈一下她，因此为大家介绍如下公式：
Intensity ∝ (NAobj)4/Mag2
在这个公式中Intensity的大小指的是荧光的强度值，而NA值这一次出现在了分子的位置，所以NA值越大，荧光强度越大，所以得到的荧光图像信噪比越高，图片质量越好。如果是进行时间序列成像，高NA值的物镜，还能大大减少曝光时间，提高成像速度，从而更好的捕捉快速移动的荧光标记物。
综上所述，虽然较为粗略和浅显，但是我们依然可以大致了解NA值的重要性，同时也对物镜也有了初步的了解，那么随之而来的问题就出现了：
NA既然如此重要，为什么物镜种类却如此千差万别？
既然NA值如此重要，显微镜厂商们都只生产高数值孔径的物镜不就好了？为什么还要生产那么多种类繁多的物镜呢？我们再回过来看看NA的计算公式：
NA = n (sin μ)
NA的大小跟介质的折射率有着直接的关系，如果各位生命科学研究者高中数学还没有忘干净的话，应该知道sin最大值只有1，所以介质折射率越大，物镜的NA值越大，这也是为什么我们高倍显微镜是油镜的原因。
答案也就随之而来，很显然，如果样本不能接触，或是加入其他介质，我们就只能选择空气作为介质，从而限制里物镜的NA值大小。那么如果可接触的话，是不是所有的样本都用高折射率的介质呢？下面我们再来看看下面要说的概念。
深层成像：球差的困扰！

上面这组实验中，我们对折射率为1.38的样本进行了200um的成像，分别用了三种不同的介质，分别是：水折射率为1.33；硅油折射率为1.40；油折射率为1.51。在样本表面成像时，油介质无愧其高NA值的强大特性，成像亮度是三种物镜之中最高的，但是当观察深度至200um的时候，油介质的物镜基本无法观察到荧光型号，而在深层观察时，成像质量最好的是折射率为1.4的硅油物镜。Why？细心的同学们应该会发现，我们所用的样本介质为1.38，而硅油的折射率是最接近样本的，所以在深层成像的时候，介质差所造成的球差就会被减到最小。这种光学现象对于学生物的同学来说可能较难理解，但是我们从左边的示意图可以看出来，当介质相近的时候，光路的焦点汇聚更加容易而不会产生在深层观察时候光线分散的情况，从而能获得较好的深层次的荧光信号。
由上面这组实验，我们可以得到很多有用的信息，好学的同学就会去查询自己常用的样本的折射率了吧？通常来说细胞样本的折射率在1.33~1.35，活体或者厚组织的折射率在1.36~1.38，因此，当我们的实验需要进行深层成像的时候，对于细胞样本我们需要尽量选用水介质的物镜，而当进行厚组织样本或者果蝇斑马鱼这样的活体深层成像时，使用硅油介质的物镜得到的图像质量会更加出色。当然，如果只是样本表面成像，油镜的成像质量绝对是最好的。
伴随着深层成像的迫切需求，空间的共定位分析，也被各位研究者们广泛使用，传统的2D共定位分析得到的结果往往是错误的不真实的。但是对于空间共定位来说，我们不可避免的就又要考虑另一个重要的物镜参数色差矫正。
空间共定位分析：不可不谈的色差
色差是什么？色差又是如何产生的？上面的图例中展示的就是色差的概念。通俗点来说就是由于不同颜色的光波长不一样，所以当她们通过光学部件的速度也不一样，因此产生了一个光斑在成像的时候颜色分散开的情况产生，这就是色差。

对于显微镜厂商的高端物镜系列，对于绿色红色的矫正都相当的出色，但是，绝大多数厂家对于近紫外的矫正都不尽如人意。这一点瑕疵在进行空间核定位的时候，就会出现很严重的问题，在获得成像结果之后，我们很难确定我们的荧光标记物与核的关系是真实的，还是由于色差造成的。
对此，各家厂商都有相对应的手段，但是只有OLYMPUS显微镜在物镜上下了功夫，推出了一款号称SC（超级色差矫正）的60倍物镜，恰巧笔者手上真好有这枚物镜，便做了如下测试。
上组实验图片用自发荧光小球作为样本，用不同激发光成像，之后做了3D重构。从图片中我们可以看出，即便是OLYMPUS的高端物镜近紫外的色差依然有0.5um左右的偏差，而SC物镜的两种颜色基本切合，误差要小于0.1um，基本上在核定位上就可以得到比较真实的实验结果了。

说了这么多概念性的东西，其实仅仅只是管中窥豹，显微镜系统要更加复杂的多，在最后的篇幅中，笔者也紧跟时代潮流，谈谈现在打得火热的双光子显微镜的物镜。

双光子的成像原理使用过双光子的同学们应该都很清楚，不同于普通的光学显微镜和共聚焦系统所采用的线性光学，双光子成像原理采用的是非线性光学，同时光源也不再是传统的可见光，在物镜的设计上不再是传统那种“真实还原样本”这样的理念了。针对双光子成像OLYMPUS最早推出了双光子成像的专用物镜，在之后Nikon也紧跟步伐推出了相应的产品。

双光子物镜首先最重要的是NA值尽量的大，这样可以有效的提高激发效率。同时，由于使用近红外成像，物镜的色差矫正也不再针对可见光而是专门对于近红外光进行矫正。在保证高NA的同时，双光子物镜的放大倍率会较小，这样可以有效的提高收集视场，增加我们收集散射荧光信号的能力，从而提高成像质量。当然，这种双光子专用物镜只能使用在双子系统上，若是在共聚焦系统中使用，效果是要大打折扣的。

wolf.p.cheng	2020-06-30 19:08
拜读学习！

yy482	2020-08-27 22:29
学习了

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